AJACSadvanced三島3

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統合データベース講習会AJACSadvanced(AJACSa)三島3

開催概要

JSTのバイオサイエンスデータベースセンター(NBDC)では、統合データベース講習会AJACSを全国の大学や研究所で開催しております。DBCLSの研究員もその講師を務めておりますが、中上級のadvancedな内容の講習会として今回、非モデル生物のRNA-seqデータ解析で活躍するTrinityを使った講習会を遺伝研研究会「次世代モデル生物におけるゲノム情報利用ワークショップ」と連続開催で行います。

日時

2016年12月16日(金)

会場

国立遺伝学研究所 宿泊棟会議室

参加対象者

− 非モデル生物でNGSデータ解析環境を作りたい方

• de novo transcriptome assembly のツールTrinityを使ってみたい方
• 次世代シーケンサーDRY解析教本Level1を一通りマスターした程度のUNIXのコマンドラインが使える方
• Mac所有者もしくはLinuxが使える方(講習はMacで。各自コンピュータを持ち込んでください。貸出はありません)
• NGSデータ解析のプロでない方。講習する方が困りますので…

プログラム

13:00～16:00 「pitagora-galaxyを使ったデータ解析環境の構築とTrinityによる Transcriptome assembly」
坊農 秀雅
(情報・システム研究機構ライフサイエンス統合データベースセンター)

Pitagora-galaxy

Galaxyとは

生物医学研究のデータ解析ために無償で利用できるWebベースの統合データ解析環境

とりあえず、使ってみる

インストールすること無く、お試しでウェブブラウザ上で

http://try.pitagora-galaxy.org/galaxy/

実用的?

そこで、仮想環境

http://www.pitagora-galaxy.org/download

参考: 統合TV「Pitagora Galaxyを使ってマウス操作だけでRNA-seq解析をする」

-【課題1】 SRAから興味深いデータを検索して、NGS tools -> FASTQC を実行してみましょう。

• 気になるFASTQデータをSRAからダウンロードしましょう
  • DBCLS SRAの利用
• 左上のアップロードアイコンにデータをアップロード

Trinity

• Trinityは、よく使われている de novo transcriptome assembly のツール。

• Citation: Nat Biotechnol. 2011 May 15;29(7):644-52. doi:10.1038/nbt.1883

-【課題2】Trinityをインストールして、SRAから興味深いRNA-seqのデータを検索して、Trinityを実行してみましょう。

インストール

• MacOSX + homebrewだと以下のコマンドでインストール完了 brew install -v Trinity

• 講習会の時点での(homebrewでインストールできる)最新バージョンは2.3.2

本体実行

• ペアエンドの場合

Trinity --seqType fq --left hoge_1.fq.gz --right hoge_2.fq.gz --max_memory 16G --CPU 4

• シングルエンドの場合

Trinity --seqType fq --single fuga.fq.bz2 --max_memory 16G --CPU 4

指定するFASTQファイルは(gzip, bzip2)圧縮されていても大丈夫の模様。--max_memoryで使用メモリ上限、--CPUで使用するCPU数を指定。

• 出力結果は、転写単位ごとの塩基配列のFASTA形式ファイル。実行したディレクトリの下にtrinity_out_dirというディレクトリが作成され、その中のTrinity.fastaというファイルがそれ。
• 参考: ぼうのブログ: Trinityで転写産物を定量する もしくはこちら（バックアップ）

発現定量

• align_and_estimate_abundance.pl を使うと、転写量を見積もって定量できる。
  • Trinityをhomebrewでインストールすると/usr/local/Cellar/trinity/2.3.2/util/以下にインストールされているはず。
• RSEM(RNA-Seq by Expectation-Maximization), bowtie2を追加インストールする必要がある
  • RSEM: http://deweylab.github.io/RSEM/ からダウンロードの上、makeしてmake install
  • bowtie2: brew install -v bowtie2でインストール可能。TopHat2を入れてあれば入っているはず。
• 以下のようなスクリプト(align_and_estimate_abundance.sh)で実行可能

/usr/local/Cellar/trinity/2.3.2/util/align_and_estimate_abundance.pl \
--thread_count 4 \
--transcripts trinity_out_dir/Trinity.fasta \
--seqType fq \
--left hoge_1.fq.gz --right hoge_2.fq.gz \
--est_method RSEM \
--aln_method bowtie2 \
--trinity_mode \
--prep_reference --output_dir rsem_outdir

-【課題3】align_and_estimate_abundance.shを用いて、発現定量してみましょう。

• 参考: ぼうのブログ: Trinityで転写産物を定量する もしくはこちら（バックアップ）

トラブルシューティング

• 多くはメモリ不足。どうしても実行できない場合は、遺伝研スパコンなど大きなメモリ空間が使えるマシン利用を検討
•  ぼうのブログ: single end readsでTrinityがコケる　もしくはこちら（バックアップ）