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文献调研：RNA editing.md

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文献调研：RNA editing

文献调研：RNA editing

背景知识 目录

RNA editing: an important post-transcriptional mechanism that alters primary RNAs through the insertion/deletion or modification of specific nucleotides

脱氨基作用 (deamination)： 如 C->U，或腺苷脱氨酶 (adenosine deaminase (ADAR) family)作用于dsRNA导致 A->I

影响：

  • UTRs：altered expression, preventing efficient ribosome binding or recognition by small regulatory RNAs
  • coding protein regions：amino acid replacements with variable functional consequences
  • In addition： influence the activity of ncRNAs such as siRNAs, miRNAs and potentially of piwiRNAs by affecting base-pairing interactions within RNA secondary structures

鉴定原理：

很简单，即将转录本与其对应的基因组序列进行比较，但是要在整个基因组范围内实现准确鉴定仍然充满挑战：在存在测序错误与mapping不准确的干扰下，怎样从基因组范围内的SNPs中鉴定出真正的RNA editing位点？

解决方法之一：use DNA-Seq data from single individuals, annotations in dbSNPs and several stringent filters

Sci.Rep: Symmetrical RNA Editing Events in the Mitochondria of Salvia miltiorrhiza 目录

参数优化：maping时bowtie选用的mismatch参数的大小？

  • 小的mismatch：低估了RNA-editing位点数
  1. 许多基因的RNA editing位点十分靠近
  2. 平均100bp的reads有3.4个位点
  • 大的mismatch：高假阳性

解决策略一："assembly-base"，用trinity进行拼接‘-SS_lib_type FR’

解决策略二："mapping-based"，尝试不同的mismatch值，2~10，最终选择最佳值7

REDItools 目录

包含三个主要脚本，用于处理来自同一样本/个体的DNA-seq和RNA-seq数据

  • REDItoolDnaRNA.py：检测候选的RNA editing位点，通过比较pre-aligned RNA-Seq 和 DNA-Seq reads（BAM format）获得

实现步骤：

1. 对RNA-seq数据，逐一扫描基因组位点并返回一个表格，表格中包含

  • coverage depth
  • the mean quality score
  • the observed base distribution
  • the strand if available
  • the list of observed substitutions as well as the frequency of variation

2. 若提供了DNA-seq数据，获得与步骤1中相似的表格数据，用于之后除去潜在的SNPs

3. 对一些位点按照一定规则进行过滤： read coverage, base quality score, mapping quality, bases supporting the variation, type of substitution and frequency

4. 去除一些位点位于：

  • homopolymeric regions of predefined length
  • intronic sequences surrounding known splice sites
  • invariant RNA-Seq positions
  • sites not supported by DNA-Seq
  • positions near read ends

  • REDItoolKnown.py：explore the RNA editing potential of RNA-Seq experiments by looking at known events only

  • REDItoolDenovo.py：不需要重测序数据，只利用RNA-seq数据进行RNA editiong的denovo检测

Nature: Dynamic landscape and regulation of RNA editing in mammals 目录

研究成果：

  • dynamic spatiotemporal patterns
  • new regulators of RNA editing
  • discovered through an extensive profiling of A-to-I RNA editing from the Genotype-Tissue Expression (GTEx) project and in hundreds of other primate and mouse samples

结论：

  • 与重复coding区域相比，非重复coding区域的RNA editing level在不同组织之间变化比较大
  • ADAR1主要编辑repetitive coding sites，ADAR2主要编辑non-repetitive coding sites，而ADAR3能抑制RNA editing

科普：mmPCR-seq 目录

a targeted RNA sequencing method that couples microfluidics-based multiplex PCR and deep sequencing

常规RNA-seq存在的问题：

  • the large dynamic range of RNA expression, which leads to inaccurate quantification of allelic ratios for genes with low-to-moderate expression levels
  • 即RNA丰度差异较大，对于中低丰度的RNA的定量不准

mmPCR-seq优点：

  • uniformly and simultaneously amplify up to 960 loci in 48 samples independently of their gene expression levels and to accurately and cost-effectively measure allelic ratios even for low-quantity or low-quality RNA samples

  • 即成比例扩增RNA片段，而不影响基因表达水平的相对定量，同时能提高对低丰度RNA的灵敏度

这个测序技术的关键在于进行类似454测序中用到的乳化PCR，即让每个RNA片段处于一个独立的PCR反应环境中

基于GATK4的分析流程 目录

1. Mapping of RNA-seq and mmPCR–seq reads

Mapping：用BWA将RNA-seq reads mapping到reference genome和已知的剪接区域附近的exonic sequences

过滤：过滤mapping结果，保留高质量的mapping结果（uniquely mapped且q > 10），并用samtools rmdup过滤PCR重复

重比对与重校正：用GATK中的 IndelRealigner 和 TableRecalibration 对保留下来的高质量的Unique reads进行局部重比对（local realignment）和碱基值重校正（base score recalibration），

2. Identification of editing sites from RNA-seq data

variant calling：用GATK中的UnifiedGenotyper来call variants，与普通的variant calling不同，这里采用了比较宽松的选项：stand_call_conf 0, stand_emit_conf 0, and output mode EMIT_VARIANTS_ONLY

remove all known SNPs：利用dbSNP数据，过滤已知的SNPs

remove false positive variant calls：过滤因技术操作原因导致的variant calling中的假阳性结果

  • required a variant call quality q > 20
  • 若variants落在read的头6个碱基里，过滤掉
  • 除去落在重复区域的variants
  • 过滤intron中离剪接位点4bp范围内的variants

Nat.Meth: Genome sequence–independent identification of RNA editing sites 目录

当前RNA editing位点鉴别存在的挑战：

  • 需要来自同一样本的genome sequence data 来过滤SNPs的影响
  • 即使提供了genome sequence data，但是由于测序覆盖度（sequencing coverage）不一致等原因，使得仍然无法完全去除SNPs的干扰

其他不需要genome sequence data的方法：use multiple RNA-seq data sets to increase the confidence of finding individual sites

存在的问题：this precludes analysis of single data sets and may miss unique changes

开发的新工具：GIREMI

优点：不需要genome sequence即可进行RNA editing位点的准确鉴定，即使RNA-seq dataset只有较低的测序深度

科普：互信息 目录

  • 首先要知道什么是信息熵

一条信息的信息量与其不确定性有着直接的关系。信息熵是消除不确定性所需信息量的度量，所以可以认为，信息量就等于不确定性的多少。

当存在n种可能的选择，如果每种选择等可能，即为1/n，则此时要做出选择没有任何其他可参考的信息，几乎就是瞎猜，则此时不确定性最大，则此时的信息熵也是最大，为log(n)，所以理论上：

max H(X) = log(n)

  • 接着来讨论什么是互信息

互信息，Mutual Information，缩写为MI，表示两个变量X与Y是否有关系，以及关系的强弱。

可以看出，I(X,Y)可以解释为由X引入而使Y的不确定度减小的量，这个减小的量为H(Y|X)，，称为条件熵

性质：

  • 如果X，Y关系越密切，I(X,Y)就越大

  • I(X,Y)最大的取值是H(Y)，此时H(Y|X)为0，意义为X和Y完全相关，在X确定的情况下Y是个定值，没有出现其他不确定情况的概率，所以为H(Y|X)为0

  • I(X,Y)取0时，代表X与Y独立，此时H(Y)=H(Y|X)，意义为X的出现不影响Y

互信息的物理解释：

GIREMI 目录

原理 目录

鉴别RNA-editing/SNP的原理：

A pair of SNPs in the same read (or read pair, in paired-end sequencing) maintains the same haplotype in the RNA as in reference genomic DNA

In contrast, a SNP and an RNA editing site exhibit variable allelic linkage because RNA editing occurs post-transcriptionally to either allele randomly

the allelic linkage for a pair of RNA editing sites may also appear random

1. Mapping of RNA-seq reads

特殊的mapping策略：enable unbiased mapping of alternative RNA alleles corresponding to RNA editing or expressed SNPs

  • 用bowtie和blat去mapping参考基因组，用bowtie去mapping转录组
  • 将三种方法的mapping结果merge在一起，形成union
  • 对union的结果进行过滤，将满足以下要求的mapped reads保留下来：
    1. 最多允许有n1个mismatches的情况下，reads有唯一的map
    2. 最多允许有n2个mismatches的情况下(n2>n1)，不mapping到其他位置上

n2和n1一般分别设置为reads长度的5%和12%

2. 识别与过滤mismatches

  • pile up
  • remove duplicate reads, except the one with the highest-quality score at the mismatch position
  • 保留满足以下条件的mismatch位点：
    1. coverage ≥5
    2. 差异位点至少出现在3条reads中

3. GIREMI：用机器学习方法来进行MI（Mutual information，互信息）的统计推断，并依此来预测RNA editing sites

Input

  • list of SNVs (mismatches)
  • known SNPs

Output

  • predicted RNA editing sites
  • their editing levels

4. 计算SNVs和RNA editing位点的MI

1. 从RNA-seq数据中提取出至少含有两个SNPs的reads

2. 用genome-dependent的方法，从RNA-seq数据中预测得到RNA editing位点

3. 用最大似然法，计算P(Si)，P(Sj) 和 P(Si,Sj)，然后就是MI：


用法 目录

该工具底层依赖的工具：

  • HTSlib：这是用于对SAM/BAM文件进行读写操作的库

    若未安装好该库，请安装，使用conda可以实现一步式安装conda install htslib；若安装成功，请将库文件所在的路径添加进 $LD_LIBRARY_PATH 环境变量

    查看 $LD_LIBRARY_PATH 环境变量

     $ echo $LD_LIBRARY_PATH
 
 /home/miniconda2/lib/

    修改 $LD_LIBRARY_PATH 环境变量

     $ export LD_LIBRARY_PATH=/Path/To/lib:$LD_LIBRARY_PATH

    由于版本更新的原因，可能出现GIREMI内部默认使用的htslib和当前新系统中安装的htslib不一致的问题，具体体现在执行 perl giremi.pl 时，出现以下报错信息：

    ./giremi: error while loading shared libraries: libhts.so.1: cannot open shared object file: No such file or directory

    解决方法：找到报错信息中指明的对应的htslib库文件，将当前库文件的文件名，比如是 libhts.so.1.8 改为 libhts.so.1 ，简单粗暴 ╮(～▽～)╭

    最后执行 perl giremi.pl ，查看配置是否成功，若输出帮助文档信息，则说明配置成功

  • samtools：用于构建参考基因组的faidx索引

    在运行GIREMI前，请提前用 samtools faidx命令构建好参考基因组的faidx索引，而且要保证参考基因组的fasta文件与faidx文件要位于同一文件夹下

  • R：用于GLM（广义线性模型）的训练与预测

Usage：

$ giremi [options] in1.bam [in2.bam [...]]

重要参数：

  • -f, --fasta-ref FILE        reference genome sequence file in fasta format
  • -m, --min INT               minimal number of total reads covering candidate editing sites [default: 5]
  • -p, --paired-end INT    1:paired-end RNA-Seq reads; 0:single-end [default: 1]

输出结果的格式说明：

参考资料：

(1) Ernesto Picardi, Graziano Pesole; REDItools: high-throughput RNA editing detection made easy.[J]. Bioinformatics, 2013, 29:1813–1814.

(2) Wu B, Chen H, Shao J, et al. Identification of Symmetrical RNA Editing Events in the Mitochondria of Salvia miltiorrhiza by Strand-specific RNA Sequencing.[J]. Scientific Reports, 2017, 7:42250.

(3) Tan M H, Li Q, Shanmugam R, et al. Dynamic landscape and regulation of RNA editing in mammals[J]. Nature, 2017, 550(7675):249-254.

(4) Rui Z, Xin L, Ramaswami G, et al. Quantifying RNA allelic ratios by microfluidic multiplex PCR and sequencing[J]. Nature Methods, 2014, 11(1):51.

(5) Zhang Q, Xiao X. Genome Sequence-Independent Identification of RNA Editing Sites[J]. Nature Methods, 2015, 12(4):347.

(6) CSDN博客：互信息（Mutual Information）的介绍

(7) GIREMI官方主页