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重复nature23883中MeRIP-seq分析

重复nature23883中MeRIP-seq分析

研究思路与成果 目录

  • 基因敲低技术发现了m6A对斑马鱼胚胎的早期发育有重要作用，并选择了该实验室擅长的斑马鱼造血系统作为研究对象。

  • 通过降低m6A的甲基化酶 （mettl3）在细胞中的水平，然后发现了4000多个mRNA的m6A 水平降低。这些target基因中，表达升高的mRNA富集在了Notch信号通路中

    • mettl3 blocked => 4000多个mRNA的m6A ↓ => 表达升高部分富集于Notch信号通路

    即： mettl3 blocked => Notch信号激活

    说明： mettl3 => m6A特异性修饰通路的关键基因 => Notch信号通路低水平表达 => EMT

  • 从这些上调基因中，选择了Notch通路中重要受体蛋白notch1a作为研究对象进行研究

    • 通过一系列实验证明mettl3 KO的胚胎中：

    mettl3 KO => notch1a m6A ↓ => notch1a表达水平升高 => 内皮无法正常向造血细胞转化

  • 接着搞清楚notch1a与EMT之间的机制

    • 结合之前发表的研究，m6A结合蛋白YTHDF2参与RNA的降解，通过RIP-seq技术，发现ythdf2能够结合notch1a，

    科普：MeRIP–seq和miCLIP–seq技术 目录

    MeRIP–seq: 通过识别m6A修饰的抗体来富集含有m6A的RNA片段，然后对这些片段进行建库和高通量测序，并通过和input比较，可以得到m6A peak的修饰强度。缺点：分辨率有限，不能够准确定位到底是哪个碱基发生化学修饰

    miCLIP: 也是用抗体富集RNA片段，通过鉴定紫外照射产生的突变位点以及RT-PCR阻断位点，可实现单碱基精度

    1. RNA extraction from HEK293 cell lines (human) or liver nuclei (mouse) using Trizol.



    2. Fragmentation of RNA to 30–130 nucleotide lengths, and incubation with anti-m6A antibody.




    3. UV cross-linking of RNA to the bound antibody.




    4. Recovery of antibody-RNA complexes with protein A/G affinity purification, SDS-PAGE and nitrocellulose membrane transfer.



    5. Adapter ligation, and release of RNA with proteinase K.



    6. Reverse transcription of RNA to cDNA, PCR amplification and sequencing.


    7. Identification of C-T transitions or truncations and alignment against known genomic sequences. Mapping and annotation of these binding sites, identified as m6A/m6Am residues, to the transcriptome.

    分析复现 目录

    Sequence motif identified 目录

    先获得各个样本peaks并集： Merge peaks

    HOMER基因组准备

    # 查看HOMER官方提供的数据包列表，寻找斑马鱼(zebrafish)的基因组数据包
$ perl configureHomer.pl -list | grep "zebrafish"
# HOMER官方提供了两个版本的斑马鱼(zebrafish)的基因组数据包，为danRer7和danRer10，我们下载较新的danRer10
$ perl configureHomer.pl -install danRer10

    接着进行Motif Identification

    # 提取对应的列给HOMER作为输入文件
# change 
#		chr1	1454086	1454256	MACS_peak_1	59.88 
#to   
#		MACS_peak_1	chr1	1454086	1454256	+

$ awk '{print $4"\tchr"$1"\t"$2"\t"$3"\t+"}' merge.bed >homer_peaks.bed


# 自己指定background sequences，用bedtools shuffle构造随机的suffling peaks
## 创建danRer10的genome文件
$ mysql --user=genome --host=genome-mysql.cse.ucsc.edu -A -e "select chrom, size from danRer10.chromInfo" >Ref/danRer10/danRer10.genome
## 注意：bed文件与genome文件的染色体表示格式是否一致，如果不一致，请先统一改为chr[1-22]|[XY]或者[1-22]|[XY]
$ awk '{print "chr"$0}' merge.bed >merge.chr.bed
$ bedtools shuffle -i merge.chr.bed -g Ref/danRer10/danRer10.genome >peaks_shuffle.bed
## 提取对应的列给HOMER作为输入文件
$ awk '{print $4"\t"$1"\t"$2"\t"$3"\t+"}' peaks_shuffle.bed >homer_peaks_shuffle.bed

# 用参数"-bg"指定background sequences，MeRIP-seq 中 motif 的长度为6个 nt
$ findMotifsGenome.pl homer_peaks.bed danRer10 Motif -bg homer_peaks_shuffle.bed -size 200 -len 6

    最后输出的motif信息保存在你指定的输出目录的homerResults.html

    富集到的第一个motif (P=1e-203) 为：

    符合保守基序为RRACH (R = G, A; H = A, C, U)的结论

    参考资料：

    (1) 探索m6A修饰在早期胚胎造血过程中的作用 | 专访基因组所Nature 共同第一作者陈宇晟

    (2) Epigenetics application spotlight: miCLIP