Trabajo Final de Máster

Máster en Bioinformática por la Escuela Técnica Superior de Ingeniería (Universidad de Valencia). Curso Académico 2021-2022. Centro de investigación I2SysBio (Paterna).

Objetivos del trabajo

Idea principal del proyecto: análisis transcriptómico del cuerpo graso de individuos adultos quasi-aposimbiontes (individuos a los que se les ha reducido drásticamente la población endosimbionte de Blattabacterium). Se hará un análisis de la expresión diferencial génica con el fin de buscar qué genes se expresan o no de forma significativa entre ambos grupos como consecuencia de la presencia/ausencia del endosimbionte. Se espera encontrar genes significativos codificantes de:

1. Proteínas que participan en el metabolismo de rutas de integración del endosimbionte
2. transportadores de la membrana simbiosomal para el tráfico de metabolitos ensosimbionte-huésped.
3. AMP -AMPlike relacionados con el control poblacional del endosimbionte

El objetivo de este repositorio es proporcionar el material suplementario sobre el software y los paquetes usados, incluyendo sus parámetros, usados durante el análisis de RNAseq de individuos de Blatella germanica. Para ello, se ha realizado un control de calidad de las muestras, un ensamblaje de novo del transcritpoma de Blatella, una cuantificación mediante pseudo-alineador (mediante la terminal de bash) y un análisis de la expresión diferencial y anotación funcional de los transcritos (ejecutado en R, versión 4.1). Los scripts pueden en contrarse en la carpeta ./scripts/ de este repositorio. Se ha tratado de acompañarlos con una breve explicación de cada paso del análisis.

1. Trinity de novo asembly

Trinity --seqType fq --max_memory 10G --left G2r-CG-pool-4_S32.trim.R1.fastq,G2r-CG-pool-3_S31.trim.R1.fastq,G2r-CG-pool-2_S30.trim.R1.fastq,G2r-CG-pool-1_S29.trim.R1.fastq,control-CG-pool-4_S28.trim.R1.fastq,control-CG-pool-3_S27.trim.R1.fastq,control-CG-pool-2_S26.trim.R1.fastq,control-CG-pool-1_S25.trim.R1.fastq --right G2r-CG-pool-4_S32.trim.R2.fastq,G2r-CG-pool-3_S31.trim.R2.fastq,G2r-CG-pool-2_S30.trim.R2.fastq,G2r-CG-pool-1_S29.trim.R2.fastq,control-CG-pool-4_S28.trim.R2.fastq,control-CG-pool-3_S27.trim.R2.fastq,control-CG-pool-2_S26.trim.R2.fastq,control-CG-pool-1_S25.trim.R2.fastq --CPU 32 --trimmomatic --output CG_transcriptome1

#o, de forma más eficiente:
cat *R1.fastq > reads.ALL.left.fq
cat *R2.fastq > reads.ALL.rigth.fq
Trinity --seqType fq --max_memory 100G --left reads.ALL.left.fq.gz --right reads.ALL.right.fq.gz --CPU 32 --trimmomatic

El resultado se recoge en ficheros/Trinity.fasta. Muchos de los pasos realizados a continuación se han tomado de: https://southgreenplatform.github.io/trainings/trinityTrinotate/TP-trinity/#practice-2

1.1 Assessing transcriptome assembly quality

1.1.1 Getting basic Assembly metrics with trinitystats.pl

Tras obtener el ensamblaje final del transcriptoma, este queda recogido en el fichero Trinity.fasta generado por Trinity (trinity_out_directory). Trinity proporciona el código TrinityStats.pl, con el cual realizar la evaluación del ensamblaje.

TrinityStats.pl trinity_out_dir/Trinity.fasta > trinityStats.log

El resultado se recoge en ficheros/trinityStats.log

1.1.2 Reads mapping back rate and abundance estimation using align_and_estimate_abundance.pl

A continuación, vamos a mapear nuestras lecturas contra el transcrito recién esnamblado. Un buen ensamblaje debería, normalmente, mapear el 80% de las reads (parejadas, entre sí), por lo menos. Para esto Trinity proporciona el script align_and_estimate_abundance.pl. Con Bowtie2, se ha seguido los siguientes pasos:

44071070 reads; of these:
  44071070 (100.00%) were paired; of these:
    3080056 (6.99%) aligned concordantly 0 times
    29199848 (66.26%) aligned concordantly exactly 1 time
    11791166 (26.75%) aligned concordantly >1 times
    ----
    3080056 pairs aligned concordantly 0 times; of these:
      317887 (10.32%) aligned discordantly 1 time
    ----
    2762169 pairs aligned 0 times concordantly or discordantly; of these:
      5524338 mates make up the pairs; of these:
        3189471 (57.73%) aligned 0 times
        1004700 (18.19%) aligned exactly 1 time
        1330167 (24.08%) aligned >1 times
96.38% overall alignment rate

# create a salmon_outdir and go on
mkdir salmon_outdir; cd salmon_outdir

# salmon
perl $path_to_trinity/util/align_and_estimate_abundance.pl \
--transcripts $fasta \
--seqType fq \
--samples_file $samplesfile \
--est_method salmon \
--trinity_mode \
--prep_reference > salmon_align_and_estimate_abundance.log 2>&1 &

2. Obtener el unigene

Mediante CD-HIT se eliminan las secuencias con un 95% o más de similitud