BowBin

Una pipeline per la rilevazione di virus in dati metagenomici

Tabella dei contenuti:

• Descrizione
• Installazione
• Requisiti
• Esecuzione di BowBin
  • Dati in input
  • Rilevazione dei virus
  • Binning
  • Dati in output
• File e cartelle
• Autori

Descrizione

BowBin è una pipeline progettata per la rilevazione di genomi virali in dati metagenomici.

BowBin riceve in input il file contenente i dati metagenomici e un insieme di genomi virali, divide i genomi virali in scaffolds, esegue Bowtie2 per allineare le reads metagenomiche con gli scaffolds e, grazie a Metabat2 e a vari scripts, genera la coverage table da cui è possibile osservare le specie di virus rilevati nei dati metagenomici, con il relativo numero di scaffolds.

Inoltre la pipeline prevede un ulteriore step di binning. In questa fase, particolarmente utile quando il numero di genomi virali dati in input è molto elevato, vengono raggruppati gli scaffolds in bin. Il processo di binning prevede l'utilizzo di Binsanity o di vRhyme, entrambi i tool utilizzano la coverage table.

Installazione

Per usare la pipeline è possibile clonare il repository

git clone https://github.com/strumenti-formali-per-la-bioinformatica/bowbin-pipeline-rilevazione-virus-dati-metagenomici

Inoltre bisogna installare i tool elencati nella sezione successiva.

Requisiti

La pipeline è stata realizzata e testata utilizzando i tool elencati di seguito. Si consiglia di utilizzare le versioni indicate per evitare problemi di compatibilità.

• Python3 (versione 3.9.13)
• Bowtie2 (versione 2.2.5)
  • Compilatore: gcc version 9.3.0
• Samtools (versione 1.6)
  • Versione htslib: 1.6
• MetaBat2 (versione 2.15)
• vRhyme
• BinSanity

Per facilitare l'installazione dei tools si consiglia l'utilizzo di anaconda e conda.

Di seguito i passi per l'installazione dei tools:

1. Creare un nuovo ambiente con python conda create -n BowBin python=3.9
2. Installare Bowtie2 conda install -c bioconda bowtie2=2.2.5 NOTA: in caso di errori dovuti a libgcc-ng o a glibc, si può utilizzare il comando sudo apt install bowtie2
3. Installare Samtools conda install -c bioconda samtools=1.6
4. Installare MetaBat2 conda install -c bioconda metabat2=2.15
5. Per installare Binsanity: https://github.com/edgraham/BinSanity/wiki/Installation
6. Per installare vRhyme: https://github.com/AnantharamanLab/vRhyme#install

NOTA: il file coverage_table_convert.py presente in vRhyme è stato modificato appositamente per questa pipeline, si consiglia di usare il file scripts/coverage_table_convert settando i flag aggiunti: -multiplyAvg e -multiplyStdev, in base ai dati in input.

Esecuzione di BowBin

Di seguito si riportano i passaggi per l'esecuzione di BowBin sui dati contenuti nella cartella example

Dati in input

La pipeline prende in input i dati metagenomici example/metagenomics.fasta e un insieme di genomi virali example/genomes.fasta

Rilevazione dei virus

Per evitare errori dovuti alla versione di Bowtie2, si può sostituire il simbolo @ con il simbolo > nei dati metagenomici con il seguente script:

• python3 scripts/remove_at.py example/metagenomics_withAt.fasta metagenomics.fasta

Dividere i genomi virali in scaffolds:

• python3 scripts/split.py example/genomes.fasta scaffolds.fasta 218. Il primo parametro di split.py è il file in input che contiene i genomi virali, il seconda parametro indica il nome del file di output, l'ultimo parametro indica la lunghezza dello scaffold espresso in numero di righe.

Creazione dell'indice Bowtie2 usando il file che contiene gli scaffolds:

• bowtie2-build scaffolds.fasta indiceScaffolds

Allineamento degli scaffolds con i dati metagenomici example/metagenomics.fasta:

• bowtie2 --no-unal --no-discordant -f -x indiceScaffolds -U metagenomics.fasta -S risultatiAllineamento.sam

Trasformazione file .sam in .bam:

• samtools view -S -b risultatiAllineamento.sam > risultatiAllineamento.bam

Ordinamento del file .bam:

• samtools sort risultatiAllineamento.bam > risultatiAllineamento.sort.bam

Creazione della coverage table:

• jgi_summarize_bam_contig_depths --outputDepth depth.txt risultatiAllineamento.sort.bam

Trasformazione della coverage table:

• python3 scripts/coverage_table_convert.py -i depth.txt -o coverage_table.tsv -multiplyAvg 900 -multiplyStdev 150.

  Al file coverage_table_convert-py di vRhyme è stato aggiunto il flag -multiplyAvg che moltiplica la media presente nella coverage table per il valore indicato, e il flag -multuplyStdev che moltiplica la deviazione standard presente nella coverage table per il valore indicato. I valori di questi due flag dipendono dai dati in input e dal processo di binning.

Rimozione delle righe con media pari a zero dalla coverage table:

• python3 scripts/remove_rows_tsv.py coverage_table.tsv

Binning

Per eseguire il binning con vRhyme:

• vRhyme -i scaffolds.fasta -o resultsvRhyme/ -c coverage_table.tsv -t 2

Per eseguire il binning con BinSanity:

• python3 scripts/generate_lognorm.py coverage_table.tsv L'esecuzione dello script generate_lognorm.py rimuove l'intestazione della coverage table e aggiunge .lognorm al nome del file.
• Binsanity -f . -l scaffolds.fasta -p -10 -c coverage_table.tsv.lognorm -o resultsBinsanity/

Dati in output

BowBin produce i seguenti file in output:

• coverage_table.tsv: in questa tabella vengono riportati gli scaffolds trovati nei dati metagenomici con la relativa media e deviazione standard
• resultsvRhyme/: in questa cartella vengono riportati i risultati del binning effettuato da vRhyme. I bin, con gli scaffolds contenuti, vengono riportati nel file vRhyme_best_bins.#.membership.tsv
• resultsBinsanity/: in questa cartella vengono riportati i risultati del binning effettuato da BinSanity. Ogni bin prodotto avrà il proprio file .fna con all'interno gli scaffolds.

I file presenti nella cartella output sono stati prodotti dall'esecuzione di BowBin sui dati example/genomes.fasta e example/metagenomics_withAt.fasta. Dalla coverage table di può notare la presenza del virus con codice NC_052974.1 e cioè Achromobacter phage vB_AchrS_AchV4. Il processo di binning invece non ha prodotto nessun bin, questo è dovuto ai pochi dati di esempio, dei bin prodotti da dati reali si possono trovare nella cartella deliverables/ERR5084065_67_69_70.

File e cartelle

• deliverables contiene i file utili alla valutazione della pipeline
  • confrontoGenomeDetectiveBowBin in questa cartella sono presenti i PDF che descrivono il confronto effettuato tra i risultati di BowBin e di Genome Detective eseguiti sui dati metagenomici ERR5084065, ERR5084067, ERR5084069, ERR5084070
  • ERR5084065_67_69_70 contiene i risultati di vRhyme, BinSanity e la coverage table prodotta dalla pipeline. Per effettuare il download dei dati metagenomici: ERR5084065, ERR5084067, ERR5084069, ERR5084070. Il file allScaffolds.fasta.gz contiene gli scaffolds utilizzati per analizzare i dati metagenomici.
  • risultatiBinSanity contiene i PDF che descrivono il binning effettuato da BinSanity
• example contiene dei file di esempio con cui è possibile testare BowBin
  • output contiene la coverage_table e i risultati di vRhyme e BinSanity ottenuti dai file genomes.fasta e metagenomics_withAt.fasta
  • genomes.fasta contiene dei genomi virali completi
  • metagenomics_withAt.fasta contiene delle reads metagenomiche
• scripts contiene gli script python necessari per l'esecuzione di BowBin
  • coverage_table_convert.py: modifica la coverage table salvata nel file depth.txt (prodotto da jgi_summarize_bam_contig_depths), questo script è stato prelevato dal tool vRhyme e sono stati aggiunti i due flag -multiplyAvg e -multiplyStdev
  • generate_lognorm.py: rimuove l'intestazione del file tsv e aggiunge .lognorm al nome del file
  • remove_at.py: sostituisce @ con > all'interno del file metagenomico
  • remove_rows_tsv.py: rimuove gli scaffolds con media pari a zero dalla coverage table
  • split.py: divide i genomi virali in scaffolds

Autori

Alessando Aquino, Nicolapio Gagliarde Contatti: a.aquino33@studenti.unisa.it, n.gagliarde@studenti.unisa.it