Cancer Cell | 38+ICB治疗是这样设计的

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Cancer Cell | 38+ICB治疗是这样设计的 by 生信人

各位小伙伴大家好啊！今天给大家分享一篇今年4月发表在Cancer Cell（IF=38.585）杂志上的文章。针对恶性胶质瘤预后差且治疗方法有限，作者通过对神经胶质瘤患者的肿瘤组织和外周血样本联合流式细胞术、scRNA-seq、scTCR-seq和bulk分析，鉴定出与预后不良相关的细胞亚群，然后通过人源化小鼠模型分析可能的ICB疗法。作者的设计环环相扣，我们一起来学习一下吧！

研究背景

神经胶质瘤细胞遗传异质性大但突变负荷低，以及恶性神经胶质瘤中肿瘤相关髓系细胞和破坏T细胞介导的抗肿瘤免疫的微血管壁龛形成的高度抑制性免疫微环境导致的恶性神经胶质瘤预后非常差，不过有越来越多的证据表明肿瘤浸润T细胞的异质性和功能状态在塑造抗肿瘤免疫和免疫治疗的应答有着关键作用，所以作者对恶性胶质瘤中T细胞进行联合分析，识别免疫治疗靶点。

结果

结果一：神经胶质瘤患者肿瘤浸润性T细胞的解剖学分析

联合流式细胞术和scRNA-seq分析152名神经胶质瘤患者的肿瘤组织和外周血样本，以分析肿瘤组织中T细胞驻留模式和转录组（图1A）。首先通过H&E和IHC对71名神经胶质瘤患者的肿瘤组织进行染色，发现大多数T细胞位于微血管的血管周围（图1B），并通过胶质瘤解剖图谱（Ivy Glioblastoma Atlas Project [GAP]）进行验证（图1C）。然后作者通过14名新诊断患者分析发现肿瘤中CD4+和CD8+ T细胞中的CCR5和CXCR3表达显着升高（图1D），可能引导T细胞浸润到神经胶质瘤中。而且肿瘤中的CD4+和CD8+ T细胞普遍表达耗竭标志物PD-1，但不表达淋巴细胞激活基因3(LAG-3)。

图1

结果二：神经胶质瘤中T细胞的单细胞聚类

肿瘤组织和PBMC配对的样本进行scRNA-seq和scTCR-seq分析来剖析TME中T细胞的异质性，将116205个细胞分为18个T细胞簇（图2A）。其中CD4+ T细胞分为7个亚群，幼稚亚群、中心记忆亚群在血液中普遍表达，而克隆扩增的细胞毒性亚群和产生IL-8的亚群在肿瘤组织中富集（图2B-D）。CD8+ T细胞分为10个亚群，富含克隆CD8+ T细胞的包括六个簇，并且高度克隆扩增的T细胞主要位于TME（图2A）。其中耗竭前CD8+ T细胞主要位于肿瘤组织，而效应/记忆CD8+ T细胞则在PBMC中富集（图2B-D）。

作者然后通过伪时间轨迹分析和TCR克隆型分析六个高度克隆扩增的CD8+ T细胞簇的发育状态和个体发育关系（图2E）。发现肿瘤富集耗竭前、耗竭和效应CD8+ T细胞亚群是主要的克隆性T细胞并广泛共享它们的克隆（图2C），表明其可能是杀死神经胶质瘤肿瘤细胞的主要参与者，并且可以作为神经胶质瘤的主要免疫治疗靶点。

图2

结果三：神经胶质瘤TME中独特的产生IL-8的CD4+ T细胞预示着不良的临床结果

T细胞有一个IL8表达为标志并只在肿瘤中富集的CD4+ T细胞亚群（图3A），而且这个亚群还具有高表达经典巨噬细胞相关效应基因和髓系细胞表面蛋白基因等先天样特征（图3B）。IHC、IF和流式细胞术发现IL-8蛋白在胶质瘤微血管周围的小部分CD4+ T细胞高表达，并且这些细胞高表达CXCR3和NINJ1（图3C）。对75份血液样本和75份胶质瘤样本分析发现IL-8在肿瘤活化的CXCR5+ CD4+ T细胞中选择性表达，而血液中表达IL-8的T细胞主要位于已灭活或幼稚的CXCR5+ CD4+ T细胞群（图3D）。

作者将关键特征基因的表达水平进行表征并作为特征分数来分析产生IL-8的T细胞簇的免疫特性与临床结果的相关性，发现在GBM中产生IL-8的CD4+ T细胞的较高特征评分与较差的生存率相关（图3E），而且IL-8的表达与其受体CXCR1和CXCR2呈正相关，并可以独立预测胶质瘤患者的不良预后（图3F）。

图3

结果四：由肿瘤分泌的刺激物分化的产生IL-8的T细胞表现出先天样特征，还具有促进体内肿瘤生长和白细胞募集的能力

与幼稚CD4+ T细胞自发表达IL-8不同，产生IL-8的T细胞仅限于终末分化和非克隆CD4+ T细胞（图2E），所以作者假设产生IL-8的T细胞被肿瘤因素极化并且独立于TCR信号传导，并通过胶质瘤肿瘤培养上清液对健康供体中幼稚CD4+ T细胞进行刺激来验证，发现T细胞中的IL-8表达以时间和剂量依赖性方式升高55%（图4A）。bulk数据的层次聚类分析表明体外分化的产生IL-8的T细胞与体内CD4_IL8簇基因表达模式相似（图4B），GSEA则发现该亚群上调巨噬细胞相关基因，产生类似于神经胶质瘤相关髓系细胞的先天样分子特征（图4C、D）。

小鼠体内实验发现接受IL-8+ CD4+ T细胞的小鼠出现显著的肿瘤生长（图4E）。肿瘤浸润性免疫细胞的离体实验显示IL-8+ CD4+ T接受组的CD45+ CD11b+ Gr1+骨髓细胞显著增加（图4F、G）。作者将20,000个GBM5细胞接种到免疫功能低下的小鼠颅内，构建神经胶质瘤异种移植小鼠模型（图4H），发现产生IL-8的T细胞分布在髓系细胞周围并且可以吸引髓系细胞（图4I），所以IL-8+ CD4+ T细胞在肿瘤中具有促肿瘤、骨髓白细胞趋化性和促血管生成等功能。

图4

结果五：恶性胶质瘤中主要由肿瘤、髓系和T细胞表达的IL-8增强了血管免疫微环境的抑制特性

GBM的snRNA-seq数据显示IL-8主要在肿瘤细胞、髓系细胞和T细胞中表达（图5A）。不过啮齿动物缺乏IL8基因，所以作者构建了人源化小鼠模型（图5B），并将表达荧光素酶的GL261细胞注射到小鼠颅内以模拟人胶质母细胞瘤，发现移植了GL261的IL8-Hu小鼠有更大的肿瘤和更短的寿命（图5C）。IHC和H&E则发现IL8-Hu小鼠的肿瘤坏死区域和血管密度增加，并伴有IL-8+多形核白细胞(PMN)浸润（图5D）。此外，IL8-Hu小鼠肿瘤中CD45+ CD3髓系细胞和CD4+ T细胞中IL-8表达显着增加（图5E），并且IL8-Hu小鼠的肿瘤浸润性CD4+和CD8+ T细胞有更多的耗竭标志物PD-1和TIM-3（图5F）。作者认为人IL-8的表达能够促进肿瘤生长加速和血管生成，以及增强TME中具有抑制性的髓系细胞(MDSC)的募集。

图5

结果六:IL-8-CXCR1/CXCR2轴的阻断与抗PD-1免疫疗法协同作用

对荷瘤小鼠腹腔注射抗PD-1抗体或同型IgG，分析了抗肿瘤反应、IL-8表达水平、髓系细胞变化和MDSCs亚群的特征等，发现抗PD-1治疗可以系统地增加IL-8表达和MDSC募集，但是这反过来又削弱了抗PD-1治疗的疗效。

作者发现对CXCR1和CXCR2具有抑制作用的reparixin导致IL8-Hu和WT小鼠的肿瘤生长显著减慢并提高了存活率（图6A、B）。流式细胞术发现reparixin治疗不仅消除了抗PD-1诱导，而且消除了肿瘤中MDSCs水平（图6C、D）。还发现PD-1阻断与reparixin联合进一步将T细胞中的Tim-3和PD-1表达降至最低水平（图6E）。因此，作者认为通过靶向CXCR1和CXCR2隔离MDSCs可以影响抗PD-1治疗神经胶质瘤的疗效。

通过将具有IL-8和荧光素酶双重表达的GL261细胞注射到IL8-Hu小鼠中，然后用PD-1和/或IL-8阻断抗体处理（图6F）。发现接受抗IL-8抗体的小鼠肿瘤明显变小，存活率提高（图6G、H）。接受抗PD-1抗体的荷瘤IL8-Hu小鼠有更高的微血管密度，而抗IL-8治疗可以降低微血管密度（图6I）。

这些结果表明IL-8的中和作用相当于阻断其受体CXCR1和CXCR2，并通过消除抑制性MDSCs来增强T细胞介导的抗肿瘤免疫力。

图6

结果七：阻断IL-8重编程神经胶质瘤TME

对肿瘤中分选的CD45+细胞进行无监督聚类（图7A-C）。与WT小鼠相比，更多的MDSCs渗入IL8-Hu的TME，抗PD-1治疗增强M-MDSC的特异性浸润，而IL-8中和会消除肿瘤浸润性M-MDSCs（图7D）。M-MDSCs易产生活性氧（图7E），说明G-MDSCs和M-MDSCs在协调肿瘤免疫抑制微环境（TIME）中作用不同。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)小神经胶质和MDMs在WT和IL8-Hu小鼠的神经胶质瘤TME中大量富集。将MDM簇重新划分为四个子簇（7G、H），发现接受非抗IL-8治疗的小鼠的肿瘤浸润性MDM细胞主要(80%)由具有免疫抑制和血管生成相关基因特征的M2样巨噬细胞组成，而接受抗IL-8单一疗法或联合疗法治疗的小鼠的MDM细胞主要由抗血管生成巨噬细胞组成（图7H、I）。伪时序分析发现IL-8的中和重编程MDMs是通过M2样巨噬细胞转换为抗血管生成巨噬细胞。常驻小胶质细胞被重新分类为四种亚型，IL-8抑制有效地消除了免疫抑制和血管生成相关基因标记的小胶质抑制性细胞（图7I-K）。

图7

最后，作者总结到IL-8阻断剂可以通过消除MDSCs和肥大细胞以及TAM的再增殖，将神经胶质瘤TME从促肿瘤状态重塑为抗肿瘤状态，从而与ICB疗法协同产生整体抗肿瘤免疫反应。

文末小结

本文涉及了肿瘤免疫抑制微环境与ICB治疗两个肿瘤研究热点，作者通过scRNA-seq和scTCR-seq分析恶性胶质瘤细胞亚群，结合TCGA的bulk数据鉴定出TME中预后不良的产生IL-8的CD4+ T细胞亚群，然后通过snRNA-seq和人源化小鼠模型分析血管免疫微环境，发现IL-8在肿瘤微环境中的作用，再通过小鼠模型分析IL-8-CXCR1/CXCR2轴的阻断与抗PD-1免疫疗法协同作用，最后对药物处理的小鼠模型进行单细胞测序，在细胞亚群中分析ICB疗法产生疗效的机制。这篇文章不但设计合理严谨，而且有很多亮点：

• 肿瘤组织和外周血形成对照发现恶性胶质瘤TME中独特的细胞亚群；
• 联合常规单细胞分析和小鼠体内实验、免疫浸润离体实验，发现产生IL-8 T细胞的特征；
• 联合样本的snRNA-seq和肿瘤细胞处理的人源化小鼠模型分析免疫抑制性微环境的特性；
• 对单独或联合使用抗PD-1、IL-8阻断剂治疗的小鼠进行单细胞分析，在细胞亚群中解析ICB疗法产生疗效的机制。
  
  

看到最后，联合流式细胞术、scRNA-seq、scTCR-seq、bulk数据和湿实验分析肿瘤免疫抑制微环境与ICB治疗的思路对你的研究有启发吗？

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