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单细胞分析：计数矩阵是如何生成的？（二）

1. 文库制备

根据所使用的文库制备方法，RNA 序列（也称为读数或标签）将来自转录本（10X Genomics、CEL-seq2、Drop-seq）的 3' 末端（或 5' 末端） , inDrops) 或来自全长转录本 (Smart-seq)。

下面列出了这些方法的以下优点：

• 3’ (or 5’)-end sequencing（3' 端测序）：
  • 通过使用区分生物复制品和扩增 (PCR) 复制品的独特分子标识符进行更准确的量化
  • 测序的细胞数量多，可以更好地识别细胞类型
  • 成本更便宜
  • 最佳结果大于10,000 个细胞
• Full length sequencing（全长测序）：
  • 检测异构体水平的表达差异
  • 鉴定等位基因特异性表达差异
  • 对少量细胞进行更深入的测序
  • 最适合细胞数量少的样品

3' 端测序与全长测序需要执行许多相同的分析步骤，但 3' 越来越受欢迎，并且在分析中包含更多步骤。因此，将详细分析来自 3' 协议的数据，重点是基于液滴的方法（inDrops、Drop-seq、10X Genomics）。

2. 3’-end

对于 scRNA-seq 数据的分析，了解每个读数中存在哪些信息以及如何在分析中使用它是有帮助的。

对于 3' 端测序方法，源自同一转录本的不同分子的读数将仅源自转录本的 3' 端，因此具有相同序列的可能性很高。然而，文库制备过程中的 PCR 步骤也可能产生重复读取。为了确定读数是生物扩增还是技术扩增，这些方法使用唯一的分子标识符或 UMI。

• 映射到相同转录本的不同 UMI 的读取来自不同的分子，并且是生物学重复，每个读取都应该被计算在内。

• 具有相同 UMI 的读取来自相同的分子并且是技术重复，应该计为单个读取。

• 在下图中，ACTB 的读取应计为单次读取，而 ARL1 的读取应分别计数。

所以需要检查 UMI，无论采用哪种液滴方法，在细胞水平上进行正确量化都需要以下内容：

• Sample index：确定读取来自哪个样本。在文库准备期间添加，需要记录。

• Cellular barcode：确定读取来自哪个单元格，每种文库制备方法都有一个在文库制备过程中使用的细胞条形码。

• Unique molecular identifier (UMI)：确定读取来自哪个转录分子，UMI 将用于折叠 PCR 重复。

• Sequencing read1：Read1 序列

• Sequencing read2：Read2 序列

3. 流程

scRNA-seq方法将确定如何从测序读数中解析条形码和 UMI。因此，尽管一些具体步骤会略有不同，但无论采用何种方法，总体工作流程通常都会遵循相同的步骤。一般工作流程如下所示：

工作流程的步骤是：

• 计数矩阵的生成：formating reads, demultiplexing samples, mapping and quantification
• 原始计数矩阵的质控：过滤劣质细胞
• 聚类：基于转录活性的相似性对细胞进行聚类（细胞类型 类似于 不同的clusters）
• marker鉴定和簇注释：识别每个簇的marker并注释已知的细胞类型簇
• 下游其他分析

无论进行何种分析，基于每个条件的单个样本得出的关于总体的结论都是不可信的。仍然需要生物重复！也就是说，如果您想得出与总体相对应的结论，请做生物学重复。

4. 计数矩阵

首先讨论此工作流程的第一部分，即从原始测序数据生成计数矩阵。将重点关注基于液滴的方法使用的 3' 端测序，例如 inDrops、10X Genomics 和 Drop-seq。

测序后，要么将原始测序数据输出为 BCL 或 FASTQ 格式，要么生成计数矩阵。如果读取是 BCL 格式，那么需要转换为 FASTQ 格式。 bcl2fastq 工具可以轻松执行此转换。

对于许多 scRNA-seq 方法，从原始测序数据生成计数矩阵经历的步骤类似。

alevin 是一个命令行工具，用于估计 scRNA-seq 数据的表达，其中转录物的 3' 末端被测序。umi-tools 和 zUMI 是可以执行这些过程的附件。这些工具结合了 UMI 以纠正假阳性。此过程中的步骤包括：

1. 格式化读取和过滤嘈杂的cellular barcodes
2. 样本拆分
3. Mapping到转录组
4. 根据UMI进行定量

如果使用 10X Genomics 文库制备方法，则 Cell Ranger 管道包含上述所有步骤。

5. 数据解析

使用 FASTQ 文件解析cell barcodes, UMIs, 和 sample barcodes。对于基于液滴的方法，由于以下原因，许多细胞条形码将匹配少量读取（< 1000 读取）：

• 从垂死的细胞中包裹自由漂浮的 RNA
• 表达少量基因的细胞（红细胞等）
• 由于未知原因死亡的细胞

在读取结果之前，需要从序列数据中过滤掉这些多余的条形码。为了进行这种过滤，提取并保存每个细胞的cellular barcode和molecular barcode。例如，如果使用umis工具，信息将添加到每次读取的header，格式如下：

@HWI-ST808:130:H0B8YADXX:1:1101:2088:2222:CELL_GGTCCA:UMI_CCCT
AGGAAGATGGAGGAGAGAAGGCGGTGAAAGAGACCTGTAAAAAGCCACCGN
+
@@@DDBD>=AFCF+<CAFHDECII:DGGGHGIGGIIIEHGIIIGIIDHII#

文库制备方法中使用的细胞条形码（cellular barcodes）是已知的，未知条形码将被丢弃，同时允许与已知细胞条形码的数量不匹配。

6. 数据拆分

如果对多个样本进行测序，则下一步是对样本进行拆分。这个过是由zUMIs完成的。需要解析读取以确定与每个单元格相关的样本条形码（sample barcode）。

7. 比对

为了确定reads来自哪个基因，使用传统 STAR 或Kallisto/RapMap进行align（对齐）。

8. 定量

重复的 UMI 被去除，只有唯一的 UMI 使用 Kallisto 或 featureCounts 等工具进行定量。结果输出是一个细胞的基因计数矩阵：

矩阵中的每个值表示来自相应基因的单元格中的读取数。使用计数矩阵，可以探索和过滤数据，只保留高质量的单元格。