这个仓库是一套双端 RNA-seq 标准分析流程。用户把原始数据、参考基因组和比较关系放到指定位置后，可以一条命令完成质控、比对、计数、差异分析、基础作图和 HTML 分析报告。
需要准备三类文件：
- 原始测序数据，通常是
.fastq.gz或测序公司给的.zip、.tar.gz - 参考基因组 FASTA，例如
.fa、.fasta、.fna - 基因注释文件，例如
.gtf、.gff3、.gff
正常情况下，只需要手动填写 09_metadata/contrasts.csv。样本表会由程序根据 FASTQ 文件名自动生成。
本模板默认所有样本来自同一批次。存在不同提取批次、建库批次或上机批次时，应重新设计模型，不要把批次问题塞进这个入门模板。
下载仓库后，进入项目目录：
cd rnaseq-pipeline-template安装软件环境：
mamba env create -f environment.yml
conda activate rnaseq_pipeline放入原始数据：
00_rawdata/ # 放 .fastq.gz 或 .fq.gz
00_archives/ # 放测序公司交付的 .zip、.tar.gz 等压缩包
放入参考基因组和注释：
04_reference/ # 放一个基因组 FASTA 和一个 GTF/GFF 注释文件
填写比较关系：
cp 09_metadata/contrasts.example.csv 09_metadata/contrasts.csv编辑 09_metadata/contrasts.csv：
comparison,numerator,denominator
Treatment_vs_Control,Treatment,Control
检查配置文件：
config/config.sh
多数用户只需要看线程数、物种类型、链特异性和 featureCounts 注释字段。配置文件内已经写了中文注释。
运行全流程：
bash scripts/run_all.sh中途停止后，修好报错，再运行同一条命令。默认 RESUME_MODE=1，已经完成的样本级结果会自动跳过。
第一次使用时，主要关心这些文件：
00_rawdata/ 或 00_archives/ # 原始数据
04_reference/ # 参考基因组和注释
09_metadata/contrasts.csv # 唯一推荐手动填写的表
config/config.sh # 少量参数
流程顺序如下：
原始 FASTQ
-> 预检查样本表、比较表、参考文件和软件环境
-> fastp 去接头和低质量 reads
-> FastQC / MultiQC 质控汇总
-> HISAT2 比对到参考基因组
-> samtools 整理 BAM 和统计比对质量
-> featureCounts 生成基因 raw counts
-> DESeq2 做差异表达分析
-> PCA / 样本相关性 / DEG 表 / 火山图 / MA 图 / 候选基因表
最终最重要的结果是：
03_multiqc/multiqc_fastq_qc.html
03_multiqc/multiqc_bam_qc.html
logs/pipeline_handoff_plan.tsv
08_counts/gene_counts.txt
10_deseq2/DEG_summary.csv
10_deseq2/comparisons/*.significant_DEGs.csv
11_figures/PCA_condition.pdf
11_figures/sample_correlation_heatmap.pdf
11_figures/*.volcano.pdf
11_figures/*.MA_plot.pdf
11_figures/DEG_UpSet_plot.pdf
11_figures/DEG_UpSet_up_genes.pdf
11_figures/DEG_UpSet_down_genes.pdf
12_enrichment/README.md
13_candidate_genes/*.top_candidate_genes_ranked.csv
14_report/RNAseq_analysis_report.html
不要改目录名。脚本按这些相对路径找文件。
rnaseq-pipeline-template/
├── 00_archives/ # 放测序公司交付压缩包
├── 00_rawdata/ # 放最终 FASTQ 文件
├── 01_clean_fastq/ # fastp 输出
├── 02_fastqc/ # fastp 和 FastQC 报告
├── 03_multiqc/ # MultiQC 汇总报告
├── 04_reference/ # 放 genome.fa 和 annotation.gtf
├── 05_hisat2_index/ # HISAT2 index
├── 07_bam/ # sorted BAM
├── 08_counts/ # featureCounts 计数结果
├── 09_metadata/ # 样本表和比较表
├── 10_deseq2/ # DESeq2 结果
├── 11_figures/ # PCA、热图、火山图、MA 图
├── 12_enrichment/ # 富集分析结果预留目录
├── 13_candidate_genes/ # 候选基因表
├── 14_report/ # HTML 分析报告
├── config/config.sh # 参数配置
├── logs/ # 每一步日志
├── scripts/ # 所有分析脚本
├── environment.yml # conda 环境文件
└── README.md
这些数据目录和结果目录里都放了一个可见的 README.md 占位文件。GitHub 不保存真正的空文件夹；保留这些占位文件，别人下载 zip 后才能看到完整目录结构。
推荐使用 mamba。
mamba env create -f environment.yml
conda activate rnaseq_pipeline如果以前已经创建过环境，后来仓库更新了依赖，用下面的命令补齐软件包：
mamba env update -n rnaseq_pipeline -f environment.yml
conda activate rnaseq_pipeline检查软件是否可用：
fastp --version
fastqc --version
multiqc --version
hisat2 --version
samtools --version
featureCounts -v
Rscript --version这些命令都能输出版本号，说明环境基本可用。某个命令不存在，就先修环境，不要继续跑流程。
原始数据有两种常见情况。
如果文件是 .fastq.gz 或 .fq.gz，直接放到：
00_rawdata/
示例：
00_rawdata/
├── Control_1_R1.fastq.gz
├── Control_1_R2.fastq.gz
├── Control_2_R1.fastq.gz
├── Control_2_R2.fastq.gz
├── Treatment_1_R1.fastq.gz
└── Treatment_1_R2.fastq.gz
.fastq.gz 是标准 FASTQ 输入格式。不要手动解成 .fastq。
如果测序公司给的是 .zip、.tar、.tar.gz、.tgz、.tar.bz2、.tbz2、.tar.xz 或 .txz，放到：
00_archives/
然后运行：
bash scripts/00_unpack_rawdata.sh本步做的事：
交付压缩包
-> 解包到 00_rawdata/
-> 递归解开内层 zip 或 tar 包
-> 保留 fastq.gz 和 fq.gz，不再解压
-> 生成 FASTQ 路径清单
本步输出：
logs/raw_fastq_files_after_unpack.tsv
logs/unpacked_delivery_archives.tsv
看 logs/raw_fastq_files_after_unpack.tsv。后面填写 metadata 时，使用这个文件里列出的 FASTQ 路径。
把参考基因组和注释文件放到：
04_reference/
不需要改成固定文件名。脚本按后缀自动识别。
基因组：*.fa、*.fasta、*.fna、*.fas
注释：*.gtf、*.gff3、*.gff
NCBI 下载的文件通常可以直接放进去，例如：
04_reference/GCF_000000000.1_genomic.fna
04_reference/genomic.gff
要求：
- 同一目录中只能放一个基因组 FASTA 和一个注释文件
- 基因组和注释必须来自同一参考版本
- 如果有多个参考文件，脚本会停止并要求你删除多余文件或在
config.sh中指定精确路径 - 参考和注释不匹配，会导致比对率低或 counts 分配率低
默认不需要填写样本表。脚本会从 FASTQ 文件名自动推断 sample_id 和 condition。
推荐命名：
00_rawdata/Control_1_R1.fastq.gz
00_rawdata/Control_1_R2.fastq.gz
00_rawdata/Control_2_R1.fastq.gz
00_rawdata/Control_2_R2.fastq.gz
00_rawdata/Treatment_1_R1.fastq.gz
00_rawdata/Treatment_1_R2.fastq.gz
脚本会推断为：
sample_id condition
Control_1 Control
Control_2 Control
Treatment_1 Treatment
也支持这类测序公司常见命名：
CGA_1.dedup.R1.fastq.gz
CGA_1.dedup.R2.fastq.gz
WT_1.dedup.R1.fastq.gz
WT_1.dedup.R2.fastq.gz
脚本会推断为：
sample_id condition
CGA_1 CGA
WT_1 WT
如果文件名不符合这个规律，再使用兜底表：
cp 09_metadata/samples.example.csv 09_metadata/samples.csvsamples.csv 只需要两列：
sample_id,condition
CGA_1,CGA
CGA_2,CGA
WT_1,WT
WT_2,WT
多数情况下不需要 samples.csv。
这是唯一推荐手动填写的表。CSV 可以用 Excel、WPS 或文本编辑器打开，不需要手动输入 tab。
cp 09_metadata/contrasts.example.csv 09_metadata/contrasts.csv打开 09_metadata/contrasts.csv，写清楚要比较哪些组。
格式：
comparison,numerator,denominator
Treatment_vs_Control,Treatment,Control
复制示例文件后，必须把示例行改成自己的比较。不要在示例行下面直接追加新比较后保留原示例行。
contrasts.csv 是唯一推荐手动修改的比较文件。metadata.tsv 和 contrasts.tsv 是程序生成的派生文件，不要手动改。
每次运行 run_all.sh 时，只要检测到 09_metadata/contrasts.csv，程序都会先删除旧的：
09_metadata/metadata.tsv
09_metadata/contrasts.tsv
logs/metadata_fastq_match.tsv
然后从 FASTQ 文件名和 contrasts.csv 重新生成。这样旧 TSV 中的残留行不会进入后续分析。
如果不小心在 contrasts.csv 保留了这一行：
Treatment_vs_Control,Treatment,Control
而你的 FASTQ 中没有 Treatment 和 Control 分组，脚本会自动忽略这条示例行，并在日志中给出警告。
含义：
| 列名 | 怎么填 |
|---|---|
comparison |
输出文件名前缀 |
numerator |
分子组，log2FC 的上方 |
denominator |
分母组，log2FC 的下方 |
上面的例子表示：
Treatment_vs_Control = Treatment / Control
如果某个基因 log2FoldChange 大于 0，表示它在 Treatment 中更高。
运行 run_all.sh 时，脚本会自动生成程序真正使用的：
09_metadata/metadata.tsv
09_metadata/contrasts.tsv
logs/metadata_fastq_match.tsv
先看 logs/metadata_fastq_match.tsv。这个文件会列出每个样本推断出的分组和匹配到的 R1/R2。
配置文件是：
config/config.sh
多数初学者只需要检查四类参数。
THREADS=8
FASTP_PARALLEL_JOBS=4
FASTP_THREADS_PER_SAMPLE=1
FASTQC_THREADS=8
ALIGN_PARALLEL_JOBS=1
HISAT2_THREADS_PER_SAMPLE=8
SAMTOOLS_SORT_THREADS_PER_SAMPLE=2
SAMTOOLS_INDEX_THREADS=2
FEATURECOUNTS_THREADS=8
BAM_QC_THREADS=8
RESUME_MODE=1这套默认值按普通家用电脑设置，约 24 逻辑 CPU、16GB 内存。它不追求把 CPU 打满，而是优先避免内存、磁盘 I/O 和排序步骤互相拖慢。
THREADS 是重计算步骤的保守线程预算。fastp 主要按样本并行提速，默认是 4 个样本并行、每个样本 1 线程。
如果使用 SSD，并且想提高 fastp 速度，可以改大：
FASTP_PARALLEL_JOBS=8
FASTP_THREADS_PER_SAMPLE=1如果数据在机械硬盘、移动硬盘或网络盘上，fastp 同时跑太多样本可能被磁盘 I/O 拖慢，保持默认或继续降低：
FASTP_PARALLEL_JOBS=2
FASTP_THREADS_PER_SAMPLE=1RESUME_MODE=1 表示默认断点续跑。已经完整生成的 clean FASTQ、fastp 报告、BAM 和索引会被复用。只有明确想全部重算时，才改成：
RESUME_MODE=0HISAT2 默认一次只比对一个样本，因为比对阶段更吃内存和磁盘。如果机器配置较高，可以改成：
ALIGN_PARALLEL_JOBS=2
HISAT2_THREADS_PER_SAMPLE=4
SAMTOOLS_SORT_THREADS_PER_SAMPLE=2不要让并行任务总线程数长期明显超过机器实际 CPU 核心数。内存不足、机械硬盘或移动硬盘运行时，不要盲目提高并行数。
默认自动识别 04_reference/ 中的参考文件：
REFERENCE_DIR=04_reference
GENOME_SUFFIXES="*.fa *.fasta *.fna *.fas"
ANNOTATION_SUFFIXES="*.gtf *.gff3 *.gff"如果目录里只有一个 .fna 和一个 .gff，不需要改名。只有在同一目录有多个候选文件时，才需要在 config/config.sh 中手动指定：
GENOME_FA=04_reference/your_genome.fna
ANNOTATION_GTF=04_reference/your_annotation.gffHISAT2 的主流程可以用于动物、植物和真菌，但剪接参数不应机械相同。
推荐起点：
| 数据类型 | 推荐设置 |
|---|---|
| 动物真核转录组 | HISAT2_SPLICE_MODE=auto，HISAT2_MAX_INTRONLEN=500000，HISAT2_DTA=1 |
| 高等植物转录组 | HISAT2_SPLICE_MODE=auto，HISAT2_MAX_INTRONLEN=100000 到 500000，HISAT2_DTA=1 |
| 真菌转录组 | HISAT2_SPLICE_MODE=auto，HISAT2_MAX_INTRONLEN=20000 到 50000，HISAT2_DTA=1 |
| 细菌或古菌转录组 | HISAT2_SPLICE_MODE=no，HISAT2_DTA=0 |
原核样品没有真核剪接结构，应关闭剪接比对。
链特异性由建库方式决定，不由物种决定。拿不准时先看测序公司报告。
| 文库类型 | HISAT2 设置 | featureCounts 设置 |
|---|---|---|
| 非链特异性 paired-end | HISAT2_RNA_STRANDNESS= |
STRANDNESS=0 |
| R1 与转录本同向 | HISAT2_RNA_STRANDNESS=FR |
STRANDNESS=1 |
| R1 与转录本反向 | HISAT2_RNA_STRANDNESS=RF |
STRANDNESS=2 |
链特异性设置错，会明显降低 featureCounts 的 Assigned 比例。
确认下面这些文件已经存在：
04_reference/ 中的基因组 FASTA
04_reference/ 中的 GTF/GFF 注释
09_metadata/contrasts.csv
如果存在 09_metadata/contrasts.csv，run_all.sh 会先调用 00_make_metadata.sh，从 FASTQ 文件名和 contrasts.csv 重建 TSV。旧的 metadata.tsv 和 contrasts.tsv 会被删除。若要完全手动使用 metadata.tsv 和 contrasts.tsv，不要保留 contrasts.csv。
原始数据至少满足以下一种情况：
00_rawdata/*.fastq.gz
00_archives/*.zip
00_archives/*.tar.gz
运行完整流程：
bash scripts/run_all.sh如果中途停止，修正问题后再次运行同一条命令。默认 RESUME_MODE=1，已经完成的样本级结果会跳过，不会把 fastp 和 HISAT2 从头全部重跑。
临时指定线程运行：
THREADS=16 bash scripts/run_all.sh这只会覆盖 THREADS。若要改变 fastp 或 HISAT2 的样本并行数，直接编辑 config/config.sh 更清楚。
本步会依次运行：
00_unpack_rawdata.sh
00_make_metadata.sh
00_preflight_check.sh
00_prepare_reference.sh
01_fastp_qc.sh
02_hisat2_align.sh
03_bam_qc.sh
04_featureCounts.sh
05_DESeq2.R
06_generate_report.R
失败时流程会停止。先看终端里的 [ERROR] 和 [HINT]，再打开 logs/ 中对应步骤的日志。
第一次使用建议分步跑。每一步成功后再进入下一步。
用 00_unpack_rawdata.sh 把测序交付包整理成可用于 metadata 的 FASTQ 路径。
bash scripts/00_unpack_rawdata.sh输入：
00_archives/ 中的交付压缩包
00_rawdata/ 中已有的 FASTQ
输出：
logs/raw_fastq_files_after_unpack.tsv
logs/unpacked_delivery_archives.tsv
解读：
raw_fastq_files_after_unpack.tsv列出最终 FASTQ 路径.fastq.gz不会继续解压- 如果没有 FASTQ，脚本会停止
用 00_preflight_check.sh 在正式分析前检查样本表、比较表、参考文件、FASTQ 路径和软件命令，提前发现会导致下游卡住的问题。
bash scripts/00_preflight_check.sh输入：
config/config.sh
09_metadata/metadata.tsv
09_metadata/contrasts.tsv
04_reference/genome.fa
04_reference/annotation.gtf
metadata 中 fastq_1 和 fastq_2 指向的 FASTQ
输出：
logs/preflight_check.tsv
logs/pipeline_handoff_plan.tsv
解读：
preflight_check.tsv全部为PASS，说明基本输入可进入正式分析pipeline_handoff_plan.tsv列出每个样本从 raw FASTQ 到 clean FASTQ 再到 BAM 的预期文件名- 这一步失败时，先修 metadata、contrasts、参考文件或软件环境，不要继续跑
用 HISAT2 建立基因组 index，并从 GTF 中提取剪接位点信息。
bash scripts/00_prepare_reference.sh输入：
04_reference/genome.fa
04_reference/annotation.gtf
输出：
05_hisat2_index/genome*.ht2
05_hisat2_index/splice_sites.txt
05_hisat2_index/exons.txt
logs/hisat2_build.log
logs/reference_genome.seqkit_stats.txt
logs/annotation_gtf_record_count.tsv
解读：
genome*.ht2存在，说明 index 建好annotation_gtf_record_count.tsv可粗略检查 GTF 中 gene 和 exon 数量- 原核模式下
splice_sites.txt和exons.txt为空是正常的
用 fastp 去接头、过滤低质量 reads，并用 FastQC 和 MultiQC 汇总质控。
bash scripts/01_fastp_qc.sh输入：
09_metadata/metadata.tsv
metadata 中 fastq_1 和 fastq_2 指向的 FASTQ
输出：
01_clean_fastq/*_clean_R1.fastq.gz
01_clean_fastq/*_clean_R2.fastq.gz
02_fastqc/*.fastp.html
02_fastqc/*_fastqc.html
03_multiqc/multiqc_fastq_qc.html
解读：
- 先看
multiqc_fastq_qc.html - 重点看 Q30、接头污染、GC 分布和过滤比例
- 某个样本明显异常，应先查原始数据和样本表
用 HISAT2 将 clean reads 比对到参考基因组，并生成排序后的 BAM。
bash scripts/02_hisat2_align.sh输入：
01_clean_fastq/*_clean_R1.fastq.gz
01_clean_fastq/*_clean_R2.fastq.gz
05_hisat2_index/genome*.ht2
输出：
07_bam/*.sorted.bam
07_bam/*.sorted.bam.bai
logs/*.hisat2.log
logs/hisat2_alignment_rate_summary.txt
解读：
- 先看
hisat2_alignment_rate_summary.txt - 同一项目内样本比对率应大体接近
- 比对率低时，优先检查参考版本、污染、宿主 RNA 混入和 FASTQ 质量
用 samtools 检查 BAM 文件的比对质量，并用 MultiQC 汇总。
bash scripts/03_bam_qc.sh输入：
07_bam/*.sorted.bam
输出：
07_bam/qc/*.flagstat.txt
07_bam/qc/*.stats.txt
07_bam/qc/mapping_rate_check.tsv
03_multiqc/multiqc_bam_qc.html
解读：
mapping_rate_check.tsv会标记低比对率样本flagstat.txt中 mapped 和 properly paired 过低时，不应继续解释 DEG
用 featureCounts 把 BAM 中的 reads 汇总到基因层面，生成 DESeq2 需要的 raw counts。
bash scripts/04_featureCounts.sh输入：
07_bam/*.sorted.bam
04_reference/annotation.gtf
09_metadata/metadata.tsv
输出：
08_counts/gene_counts.txt
08_counts/gene_counts.txt.summary
logs/featureCounts.log
解读：
gene_counts.txt是 DESeq2 的输入gene_counts.txt.summary中Assigned越高越好Unassigned_NoFeatures高，常见原因是参考基因组和 GTF 不匹配Assigned很低，也要检查STRANDNESS
用 DESeq2 基于 raw counts 做差异表达分析，并输出图表和 DEG 表。
Rscript scripts/05_DESeq2.R输入：
08_counts/gene_counts.txt
09_metadata/metadata.tsv
09_metadata/contrasts.tsv
输出：
10_deseq2/normalized_counts.csv
10_deseq2/vst_expression_matrix.csv
10_deseq2/DEG_summary.csv
10_deseq2/comparisons/*.all_results.csv
10_deseq2/comparisons/*.significant_DEGs.csv
11_figures/PCA_condition.pdf
11_figures/sample_correlation_heatmap.pdf
11_figures/*.volcano.pdf
11_figures/*.MA_plot.pdf
11_figures/DEG_UpSet_plot.pdf
11_figures/DEG_UpSet_up_genes.pdf
11_figures/DEG_UpSet_down_genes.pdf
12_enrichment/README.md
13_candidate_genes/*.top_candidate_genes_ranked.csv
14_report/RNAseq_analysis_report.html
解读：
- 先看 PCA 和样本相关性
- 样本关系正常后，再看 DEG 数量和 DEG 表
- DEG 是统计关联，不是因果证明
用 06_generate_report.R 汇总材料方法、质控结果、差异表达结果、候选基因和结果解读，生成一个可直接打开的网页报告。
Rscript scripts/06_generate_report.R输入：
09_metadata/metadata.tsv
09_metadata/contrasts.tsv
logs/*.tsv
03_multiqc/*.html
08_counts/gene_counts.txt.summary
10_deseq2/DEG_summary.csv
10_deseq2/comparisons/*.csv
11_figures/*.pdf
13_candidate_genes/*.csv
输出：
14_report/RNAseq_analysis_report.html
解读：
- 这是最终给用户查看的总报告
- 报告内包含材料方法、项目概览、质控结果、差异表达结果和候选基因表
- 图表以 PDF 形式嵌入或链接，若浏览器不直接显示 PDF，可点击链接单独打开
按这个顺序检查：
03_multiqc/multiqc_fastq_qc.htmllogs/hisat2_alignment_rate_summary.txt03_multiqc/multiqc_bam_qc.html08_counts/gene_counts.txt.summary11_figures/PCA_condition.pdf11_figures/sample_correlation_heatmap.pdf10_deseq2/DEG_summary.csv10_deseq2/comparisons/*.significant_DEGs.csv13_candidate_genes/*.top_candidate_genes_ranked.csv14_report/RNAseq_analysis_report.html
判断原则：
- 质控不过，不解释差异基因
- 样本聚类异常，不解释差异基因
- 只看 DEG 数量没有意义，必须结合样本关系和研究设计
- 候选基因表用于后续注释、富集和实验验证
脚本停止时会输出两类信息：
[ERROR] 停止原因
[HINT] 处理建议
常见情况：
| 报错 | 常见原因 | 处理 |
|---|---|---|
Contrast file not found |
没有创建 contrasts.csv |
运行 cp 09_metadata/contrasts.example.csv 09_metadata/contrasts.csv 后编辑 |
Removed leftover example contrast |
比较表中存在默认示例行，但样本里没有对应分组 | 脚本已自动忽略这行；最终使用的文件以重新生成的 contrasts.tsv 为准 |
Cannot detect R1/R2 |
FASTQ 文件名没有明确 R1/R2 | 改成 Sample_1_R1.fastq.gz 和 Sample_1_R2.fastq.gz |
Ambiguous FASTQ pairing |
一个样本匹配到多个 R1 或 R2 | 改 FASTQ 文件名，或提供 samples.csv 兜底 |
Conditions in contrasts are not present |
自动推断出的分组和 contrasts 不一致 | 检查 FASTQ 命名，或提供 samples.csv 明确定义分组 |
Metadata file not found |
没有创建 metadata.tsv |
优先运行 bash scripts/00_make_metadata.sh 自动生成 |
Metadata header is invalid |
表头不是规定格式 | 第一行必须是 sample_id condition fastq_1 fastq_2，用 tab 分隔 |
R1 FASTQ not found |
FASTQ 路径写错 | 按 logs/raw_fastq_files_after_unpack.tsv 改 metadata |
No FASTQ files found in 00_rawdata |
没有放 FASTQ 或交付包 | 把 .fastq.gz 放入 00_rawdata/，或把交付压缩包放入 00_archives/ |
Nested archive unpacking stopped |
内层压缩包嵌套过深 | 调高 UNPACK_MAX_ROUNDS，或手动检查 00_rawdata/ |
HISAT2 index not found |
没有建 index | 先运行 bash scripts/00_prepare_reference.sh |
Clean FASTQ not found |
没有运行 fastp | 先运行 bash scripts/01_fastp_qc.sh |
BAM not found |
没有完成比对 | 先运行 bash scripts/02_hisat2_align.sh |
Invalid STRANDNESS |
链特异性参数写错 | 使用 0、1 或 2 |
metadata.tsv contains a batch column |
加入了 batch 列 | 删除 batch 列，本模板只处理同一批次样本 |
Conditions in contrasts.tsv but not in metadata |
分组名不一致 | 保证 contrasts 中的分组名出现在 metadata 的 condition 列 |
不要跳过报错继续运行。报错说明当前输入不满足后续分析要求。
| 文件 | 含义 | 怎么看 |
|---|---|---|
multiqc_fastq_qc.html |
FASTQ 质控汇总 | 看测序质量、接头污染、GC 分布 |
hisat2_alignment_rate_summary.txt |
HISAT2 比对率 | 样本间应大体一致 |
multiqc_bam_qc.html |
BAM 质控汇总 | 看 mapped、properly paired |
gene_counts.txt.summary |
reads 分配统计 | Assigned 越高越好 |
normalized_counts.csv |
DESeq2 标准化 counts | 用于展示，不用于重新做差异分析 |
vst_expression_matrix.csv |
方差稳定化矩阵 | 用于 PCA、聚类、热图 |
PCA_condition.pdf |
PCA 图 | 看重复是否聚在一起 |
sample_correlation_heatmap.pdf |
样本相关性热图 | 看组内一致性 |
DEG_summary.csv |
DEG 数量汇总 | 比较不同 contrast 的扰动强度 |
*.all_results.csv |
所有基因差异结果 | 保留完整统计结果 |
*.significant_DEGs.csv |
显著差异基因 | 默认 padj < 0.05 且 abs(log2FC) >= 1 |
*.volcano.pdf |
火山图 | 看显著性和变化倍数 |
*.MA_plot.pdf |
MA 图 | 看差异是否集中在低表达基因 |
DEG_UpSet_plot.pdf |
全部显著 DEG 交集图 | 不区分上下调 |
DEG_UpSet_up_genes.pdf |
上调基因交集图 | 只统计上调 DEG |
DEG_UpSet_down_genes.pdf |
下调基因交集图 | 只统计下调 DEG |
*.top_candidate_genes_ranked.csv |
候选基因排序 | 用于后续注释和验证 |
RNAseq_analysis_report.html |
最终 HTML 报告 | 汇总材料方法、结果和解读 |