单细胞转录组数据分析流程复现（GSE267764）

项目简介

本项目复现论文：

Kimura K, Subramanian A, Yin Z, Khalinezhad A et al.
Immune checkpoint TIM-3 regulates microglia and Alzheimer's disease.
Nature, 2025, 641(8063):718–731.

数据来源：
GEO 数据集 GSE267764

• GEO 数据链接：
  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE267764

本项目主要复现论文中的单细胞转录组（scRNA-seq）分析流程，包括：

• Seurat 数据预处理
• Harmony 批次矫正
• UMAP 聚类分析
• 细胞类型注释
• DoubletFinder 双细胞检测
• 差异表达分析（DGE）
• 火山图可视化

由于原始数据规模较大，本项目主要针对论文中的核心单细胞分析流程进行复现与验证。

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方法概述

本项目基于 Seurat v5 单细胞分析框架，对 GSE267764 数据集进行了完整的 scRNA-seq 标准分析流程复现。

相较于传统 Seurat v4 教程，本复现特别针对 Seurat v5 的 Layer 机制进行了兼容性修复，包括：

• 使用 LayerData() 代替旧版 counts 提取方式
• 使用 JoinLayers() 解决差异分析中的多图层问题
• 修复 DoubletFinder 与 Seurat v5 的兼容问题
• Harmony 批次校正整合多样本
• 构建 microglia 亚群注释体系
• 复现论文中的 DEG 火山图

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复现结果

模块	复现结果
数据类型	单细胞转录组（scRNA-seq）
分析框架	Seurat v5
批次矫正	Harmony
双细胞检测	DoubletFinder
聚类参数	npc = 50, resolution = 0.4
差异分析方法	Wilcoxon rank-sum test
可视化结果	UMAP、火山图
输出文件	DEG_of_HMG.pdf

成功复现内容包括：

• UMAP 聚类结果
• 小胶质细胞（Microglia）亚群划分
• DoubletFinder 双细胞识别
• 差异表达基因筛选
• HMG vs CC HMG1 火山图

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小组信息

成员	学号	分工	github
邹林	2025303110139	合适论文寻找、初始框架建立、README 编写	@huanyu8
林观清	2025303120114	论文图复现	@LGQ559492
郑永琪	2025303120147	论文图复现	@zcguksjv65
李迁	2025303120110	论文图复现	li20010229-eng
黄子凯	2025303110141	项目整理、Quarto 文档转换、最终提交	@hirasauayui

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目录结构

scRNAseq-GSE267764/
├── README.md
├── requirements.txt
├── environment.yml
├── .gitignore
├── data/
│   └── README.md                  # 数据获取说明
├── notebooks/
│   ├── 01_preprocessing.qmd       # 数据预处理
│   ├── 02_harmony_cluster.qmd     # Harmony 聚类分析
│   ├── 03_cell_annotation.qmd     # 细胞类型注释
│   ├── 04_doubletfinder.qmd       # 双细胞检测
│   ├── 05_DGE_analysis.qmd        # 差异表达分析
│   └── 06_volcano_plot.qmd        # 火山图绘制
├── outputs/
│   ├── figures/
│   └── DEG_of_HMG.pdf
└── scripts/
    └── utils.R

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完整复现步骤

第一步：克隆仓库

git clone https://github.com/your-repo/scRNAseq-GSE267764.git
cd scRNAseq-GSE267764

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第二步：安装 R 环境

本项目使用：

R version 4.6.0

推荐使用：

• RStudio
• Quarto
• Rtools（Windows）

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第三步：安装依赖包

在 R 中运行：

install.packages(c(
  "Seurat",
  "ggplot2",
  "dplyr",
  "patchwork",
  "harmony",
  "DoubletFinder",
  "tibble",
  "ggrepel"
))

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第四步：下载 GEO 数据

从 GEO 下载原始数据：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE267764

解压后目录结构如下：

GSE267764_RAW/
├── GSMxxxxxxx_barcodes.tsv.gz
├── GSMxxxxxxx_features.tsv.gz
├── GSMxxxxxxx_matrix.mtx.gz
└── ...

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第五步：整理 10X 数据目录

运行如下代码：

data_dir <- "你的数据路径/GSE267764_RAW"

fs <- list.files(data_dir, pattern = "GSM", full.names = FALSE)

samples <- substr(fs, 1, 10)

lapply(unique(samples), function(x) {

  y <- fs[grepl(x, fs)]

  folder <- file.path(
    data_dir,
    paste(strsplit(y[1], split = "_")[[1]][1:2], collapse = "_")
  )

  dir.create(folder, recursive = TRUE, showWarnings = FALSE)

  file.rename(file.path(data_dir, y[1]), file.path(folder, "barcodes.tsv.gz"))
  file.rename(file.path(data_dir, y[2]), file.path(folder, "features.tsv.gz"))
  file.rename(file.path(data_dir, y[3]), file.path(folder, "matrix.mtx.gz"))
})

⚠️ 注意：

该步骤第二次运行时会报错。
原因是原始文件已经被移动。

解决办法：

• 重新解压 GEO 原始文件
• 或备份原始数据目录

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第六步：运行 Seurat 预处理

主要步骤包括：

• 创建 Seurat 对象
• 合并样本
• 线粒体比例计算
• 质量控制过滤

过滤条件：

nCount_RNA >= 1000
nFeature_RNA >= 200
percent.mt < 80

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第七步：Harmony 批次矫正与聚类

核心参数：

npc = 50
resolution = 0.4

主要流程：

NormalizeData()
FindVariableFeatures()
ScaleData()
RunPCA()
RunHarmony()
RunUMAP()
FindNeighbors()
FindClusters()

随后去除低质量 Cluster6：

scRNAseq_cortex <- subset(
  scRNAseq_cortex,
  seurat_clusters %in% c(0:5, 7:10)
)

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第八步：细胞类型注释

根据原论文定义 microglia 亚群：

Cluster	Cell Type
0	HMG
1	HMG
2	MGnD 0
3	MGnD1
4	CC HMG1
5	CC HMG2
7	IFN HMG
8	IFN HMGD
9	CC MGnD
10	MGnD 2

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第九步：DoubletFinder 双细胞检测

本项目特别修复了 Seurat v5 与 DoubletFinder 的兼容问题。

关键修改：

修复 1：使用 LayerData 提取 counts

counts_sub <- LayerData(
  sc_sub_cortex,
  assay = "RNA",
  layer = "counts"
)

修复 2：重新创建单层 Seurat 对象

sc_sub_simple <- CreateSeuratObject(
  counts = counts_sub,
  meta.data = metadata_sub
)

修复 3：运行 DoubletFinder

sc_sub_simple <- doubletFinder(
  sc_sub_simple,
  PCs = 1:50,
  pK = pK,
  nExp = nExp_poi.adj
)

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第十步：差异表达分析（DGE）

使用：

FindMarkers()

统计方法：

Wilcoxon rank-sum test

关键修复：

subset_obj <- JoinLayers(subset_obj)

用于解决 Seurat v5 多 Layer 差异分析问题。

显著性筛选条件：

p_val_adj < 0.05
abs(avg_log2FC) > 0.25
pct.1 > 0.3

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第十一步：绘制火山图

复现内容：

• HMG vs CC HMG1
• 上调基因
• 下调基因
• 基因标签标注

输出文件：

DEG_of_HMG.pdf

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常见问题

Q1：Read10X 无法读取数据？

A：请确认目录结构为：

sample/
├── barcodes.tsv.gz
├── features.tsv.gz
└── matrix.mtx.gz

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Q2：Harmony 报错？

A：请确认已安装：

install.packages("harmony")

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Q3：DoubletFinder 与 Seurat v5 不兼容？

A：必须使用：

LayerData()
JoinLayers()

避免 multi-layer 报错。

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Q4：第二次运行文件整理代码失败？

A：因为原始文件已被移动。
请重新解压 GEO 原始数据。

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Q5：FindMarkers 报 Layer 错误？

A：需要先执行：

subset_obj <- JoinLayers(subset_obj)

---

参考文献

@article{kimura2025tim3,
  title={Immune checkpoint TIM-3 regulates microglia and Alzheimer's disease},
  author={Kimura, K and Subramanian, A and Yin, Z and Khalinezhad, A},
  journal={Nature},
  volume={641},
  number={8063},
  pages={718--731},
  year={2025}
}