3.a Acoplamiento Molecular (Docking)

En esta sección abordaremos el procedimiento para obtener el complejo enzima-sustrato utilizando la técnica de Docking molecular. Esta técnica se realiza utilizando el programa Autodock vina en el siguiente link https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19499576, se puede revisar el articulo original sobre el funcionamiento del programa. Enseguida se abordan los pasos para obtener el complejo enzima-sustrato y su respectiva energía de afinidad.

Preparación de los archivos de entrada

1.- Como punto de partida debemos contar con la estructura de la enzima(previamente revisada para que cuente con todos los residuos y loops completos) y el sustrato previamente minimizado en formato pdb.

2.- Una vez que se tienen las estructuras en formato pdb, utilizamos el programa AutodockTools, este programa nos va a permitir la preparación de estos archivos para realizar el docking molecular.

3.- Comenzamos a preparar el archivo de entrada para el caso de la enzima, abrimos el archivo con AutodockTools y procedemos a agregar los hidrogenos polares utilizando los siguientes pasos:

Edit ---> Hidrogens ---> Add ---> Polar only

3.1.- Un punto importante es que para poder realizar el docking molecular debemos tener identificado el sitio activo de nuestra enzima ya que debemos delimitar una zona de búsqueda donde el programa buscara la conformación de menor energía para el sustrato. En algunas ocasiones no contamos con la información del sitio activo, en esos caso podemos utilizar el servidor http://sts.bioe.uic.edu/castp/, el cual identifica los pockets de la enzima y generalmente usamos el que tenga el mayor volumen.

4.- Una vez que tenemos identificados los residuos que forman parte del sitio activo se seleccionan con el propósito de que el espacio de búsqueda tome en cuenta estos residuos y sea más fácil encontrar la conformación más estable del complejo enzima-sustrato.

5.- Para seleccionar los residuos se realizan los siguientes pasos:

Select ---> Select from string ---> en la sección Residue se coloca el nombre y el número de residuo(Ej. SER80 todo en mayúscula).

6.- Una vez que tenemos seleccionados a todos los residuos de interés procedemos a generar el espacio de búsqueda utilizando los siguientes pasos:

Grid ---> Macromolecule ---> enzyme(nombre de la enzima)

Una vez que se selecciona la enzima se abre el submenu grid box, aparece un cubo de colores, el cual nos va a servir como marcador para delimitar la zona de búsqueda.

7.- En el botón spacing se pone en 1.000 angstroms y a partir de ahí vamos ajustando el tamaño del cubo de colores de tal forma que todos los residuos antes seleccionados queden dentro de la caja. El tamaño de la caja debe ser de 30X30X30. Se debe procurar que la caja cubra lo más posible de la zona de búsqueda, al cual corresponderá al sitio activo.

8.- Debemos guardar los datos que se obtienen para la el espacio de búsqueda en el submenu grid box, ya que estos datos van a corresponder al tamaño de la caja y a la orientación de esta en el espacio(X_center, Y_center, Z_center). Con esta información podemos generar un archivo de configuración, el cual va a ser necesario para ejecutar el programa Autodock vina. En el siguiente link config.txt adjuntamos un ejemplo de un archivo de configuración.

Preparación del sustrato

1.- En esta etapa vamos a trabajar en la preparación del sustrato, tenemos nuestro sustrato en formato pdb y vamos a abrirlo con el programa AutodockTools, en el menú File ---> Read Molecule ---> my substrate.

2- En este paso vamos a agregar los hidrógenos polares al sustrato, de igual manera como se hizo con la enzima.

3.- Una vez que tenemos los hidrógenos polares, abrimos el menú ligand y ahí seleccionamos la pestaña input y escogemos la molécula que corresponde al sustrato, siguiente estas instrucciones ligand ---> input ---> choose ---> select ---> add

4.- Ya que se selecciono el sustrato seguimos los siguientes pasos para asignar los grados de libertad que va a tener nuestro sustrato. Nosotros generalmente seleccionamos el número de grados de libertad que da el programa por default, seguimos las siguiente ordenes ligand ---> torsion tree ---> set number of torstions ---> dismiss.

5.- Finalmente el sustrato se le agregan las cargas automáticamente y se guarda en formato pdbqt con el cual podemos proceder a realizar el cálculo de docking.

Ejecución del programa Autodock Vina

1.- Una vez que se tiene la enzima y el sustrato en formato pdbqt y además tenemos el archivo config.txt donde se indican las dimensiones de la caja, procedemos a crear una carpeta que contenga el archinvo config.txt, el ejecutable del programa y los archivos en formato pdbqt de la enzima y el sustrato.

2.- El programa se ejecuta utilizando la siguiente orden: ./vina -config.txt -log log.txt

3.- El archivo log.txt va a contener todas las configuraciones posibles del sustrato en el área de búsqueda con su correspondiente energía de afinidad y van a estar ordenadas de menor a mayor energía. El archivo out.pdbqt va a contener todas las configuraciones encontradas de nuestro sustrato en formato pdbqt.

4.- Los resultados pueden ser visualizados en el programa de nuestra preferencia, en este momento estamos trabajando con el programa Discovery Studio 2016 en su versión gratuita, y ha resultado ser una herramienta muy buena.