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復習問題５ クオリティコントロールとNGS 基本ツール

計算機を利用する受講生と自分のPCを利用する聴講生では演習環境に差が生じるため、各問題において作業ディレクトリを適宜読み替えること。
例: ~/gitc/data/5_ngs 等と記載している場合、利用者各自の判断で ~/Desktop/gitc/data/5_ngs と読み替える など。

~/gitc/data/5_ngs に移動せよ

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2D2L_rep1_R1.fastq と 2D2L_rep1_R2.fastq ファイルはアラビドプシスの発芽・緑化後の芽⽣えをサンプリング、ライブラリー作製した paired-end read (76base x2) の RNA-Seq の⽣リードの fastq ファイルである。cutadapt のパラメータは以下を参考にせよ。

-q 30
-O 7
-m 50
-a AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA
-A AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT

1. 1. 上記のパラメータを用い、2D2L_rep1_R1.fastq と 2D2L_rep1_R2.fastq を paired-endでの cutadapt にかけよ。
   2. cutadapt のlog を⾒て、pass したpair 数、quality trim されたbase 数を調べよ。
   3. cutadapt 処理前後の fastq ファイルを less コマンド等で⾒⽐べよ
   4. wc コマンドで cutadapt 前後のread 数を調べよ。
   5. cutadapt 処理前後の fastq ファイルを fastqc にかけ、cutadapt 処理による、低品質配列が除かれていることを確認せよ。

2. seqkit を使ってリードファイル ecoli.2.fastq ecoli.3.fastq の statistic 情報を確認せよ。

3. bowtie2 を使って、リードファイル ecoli.2.fastq ecoli.3.fastq を、リファレンス eco にマッピングし、結果をファイル eco_ex.sam に出⼒せよ。その際、リードファイルはカンマ区切りで複数指定できることを使え。

4. samtools を使って、eco_ex.sam を bam フォーマットに変換し、eco_ex.bam として保存せよ

5. samtools を使って、eco_ex.bam をソートし、eco_ex_sorted.bam として保存せよ。現⾏ samtools は4および5 の作業は⼀度にできうるが過程確認のため、今回は個別に⾏う。

6. samtools を使って、eco_ex_sorted.bam にインデックスを作成せよ

7. samtools を使って、eco_ex_sorted.bam から以下の遺伝⼦にマップされたリードを取り出して数を数えよ。抽出された⾏を数えるには、wc コマンドを使うこと。

染⾊体名	開始位置-終了位置	遺伝⼦名
chr	337 - 2799	thrA
chr	4179268 - 4183296	rpoB